FKM多光譜熒光動態顯微成像系統

FKM（Fluorescence Kinetic Microscope）多光譜熒光動態顯微成像系統是目前功能強大全面的植物顯微熒光研究儀器，是基于FluorCam葉綠素熒光成像技術的顯微成像定制系統。它由包含可擴展部件的增強顯微鏡、高分辨率CCD相機、激發光源組、光譜儀、控溫模塊以及相應的控制單元和專用的工作站與分析軟件組成。它不僅可以進行微藻、單個細胞、單個葉綠體乃至基粒-基質類囊體片段進行Fv/Fm、Kautsky誘導效應、熒光淬滅、OJIP快速熒光響應曲線、QA再氧化等各種葉綠素熒光及MCF多光譜熒光（multicolor fluorescence）成像分析；還能通過激發光源組進行進行任意熒光激發和熒光釋放波段的測量，從而進行GFP、DAPI、DiBAC4、SYTOX、CTC等熒光蛋白、熒光染料以及藻青蛋白、藻紅蛋白、藻膽素等藻類熒光色素的成像分析；更可以利用光譜儀對各種熒光進行光譜分析，區分各發色團（例如PSI和PSII及各種捕光色素復合體等）并進行深入分析。

FKM多光譜熒光動態顯微成像系統使熒光成像技術真正成為光合作用機理研究的探針，使科研工作者在藻類和高等植物細胞與亞細胞層次深入理解光合作用過程及該過程中發生的各種變化，為直接研究葉綠體中光合系統的工作機理提供了有力的工具。FKM作為藻類/植物表型和基因型顯微研究的雙重利器，得到了學界的廣泛認可并取得了大量的科研成果。

功能特點

?內置現今葉綠素熒光研究的全部程序，如Fv/Fm、Kautsky誘導效應、熒光淬滅、OJIP快速熒光響應曲線、QA再氧化等，可獲得70余項參數。

?配備10倍、20倍、40倍、63倍和100倍專用生物熒光物鏡，可以清晰觀測到葉綠體及其發出的熒光。

?激發光源組中包括紅外光、紅光、藍光、綠光、白光、紫外光和遠紅光等，通過紅藍綠三色光還可以調出可見光譜中的任何一種色光，能夠研究植物/藻類中任何一種色素分子或發色團。

?可進行GFP、DAPI、DiBAC4、SYTOX、CTC等熒光蛋白、熒光染料的成像分析

?高分辨率光譜儀能夠深入解析各種熒光的光譜圖。

?控溫系統可以保證實驗樣品在同等溫度條件下進行測量，提高實驗精度，也可以進行高溫/低溫脅迫研究。

應用領域

? 微藻、大型藻類/高等植物的單個細胞、單個葉綠體、基粒-基質類囊體片段等的顯微結構植物光合生理研究

? 藻類/植物逆境研究

? 生物和非生物脅迫的研究

? 藻類/植物抗脅迫能力及易感性研究

? 突變體篩選及光合機理研究

? 藻類長勢與產量評估

? 藻類色素與光合作用關系

? 藻類/植物——微生物交互作用研究

? 藻類/植物——原生動物交互作用研究

? 基因工程與分子生物學研究

測量樣品

? 植物活體切片

? 植物表皮

? 植物細胞

? 綠藻、藍藻等各種單細胞和多細胞微藻

? 葉綠體提取液

? 類囊體提取液

? 含有葉綠體的原生動物

工作原理

FKM分析過程中，通過連接在顯微鏡上的激發光源組和內置在6位濾波輪中的一系列濾波器、分光鏡激發植物樣品中各種發色團的動態熒光。樣品激發出的熒光經顯微鏡放大后進行熒光光譜分析和熒光動力學成像分析。SM 9000光譜儀通過光纖與顯微鏡連接，以進行激發熒光光譜分析。安裝在顯微鏡頂部的高分辨率CCD相機則用于熒光動力學成像分析。全部工作過程通過工作站和控制單元按照預先設定好的程序自動進行。測量過程中，可通過溫控模塊調控藻類、植物細胞等實驗樣品的溫度。蠕動泵可以實現培養藻類的連續測量。

儀器組成

1. 增強顯微鏡

2. 高分辨率CCD相機

3. 激發光源組

4. SM 9000光譜儀

5. 主控制單元

6. 工作站及軟件

7. 控溫模塊的控制單元

8. 6位濾波輪

技術參數

? 測量參數

?Fo, Fo’, Fs, Fm, Fm’, Fp, FtDn, FtLn, Fv, Fv'/ Fm', Fv/ Fm ,Fv',Ft,ΦPSII, NPQ_Dn, NPQ_Ln, Qp_Dn, Qp_Ln, qN, qP，QY, QY_Ln, Rfd, ETR等50多個葉綠素熒光參數，每個參數均可顯示2維熒光彩色圖像

?OJIP快速熒光曲線：測定分析OJIP曲線與二十幾項相關參數包括：Fo、Fj、Fi、P或Fm、Vj、Vi、Mo、Area 、Fix Area、Sm 、Ss 、N（QA還原周轉數量）、Phi???_Po 、Psi_o 、Phi_Eo、Phi_Do、Phi_pav、ABS/RC（單位反應中心的吸收光量子通量）、TRo/RC（單位反應中心初始捕獲光量子通量）、ETo/RC（單位反應中心初始電子傳遞光量子通量）、DIo/RC（單位反應中心能量散失）、ABS/CS（單位樣品截面的吸收光量子通量）、TRo/CSo、RC/CSx（反應中心密度）、PIABS（基于吸收光量子通量的“性能"指數或稱生存指數）、PIcs（基于截面的“性能"指數或稱生存指數）等（選配）

?GFP、DAPI、DiBAC4、SYTOX、CTC等熒光蛋白和熒光染料的成像分析（選配）

?QA再氧化動力學曲線（選配）

?Spectrum熒光光譜圖（選配）

?具備完備的自動測量程序（protocol），可自由對自動測量程序進行編輯

?Fv/Fm：測量參數包括Fo，Fm，Fv，QY等

?Kautsky誘導效應：Fo，Fp，Fv，Ft_Lss，QY，Rfd等熒光參數

?熒光淬滅分析：Fo，Fm，Fp，Fs，Fv，QY，ΦII，NPQ，Qp，Rfd，qL等50多個參數，2套制式程序

?光響應曲線LC：Fo，Fm，QY，QY_Ln，ETR等熒光參數

?Dyes & FPs穩態熒光成像測量

?OJIP快速熒光動力學分析：Mo（OJIP曲線初始斜率）、OJIP固定面積、Sm（對關閉所有光反應中心所需能量的量度）、QY、PI等26個參數（選配）

?QA再氧化動力學（選配）

?Spectrum熒光光譜分析（選配）

?熒光激發光源：紅外光、紅光、橙光、藍光、綠光、白光、紫外光等可選，根據客戶要求定制光源組

?透射光源（選配）：白光、遠紅光

?高分辨率TOMI-2 CCD傳感器：

?逐行掃描CCD

?圖像分辨率：1360×1024像素

?時間分辨率：在圖像分辨率下可達每秒20幀

?A/D 轉換分辨率：16位（65536灰度色階）

?像元尺寸：6.45µm×6.45µm

?運行模式：1）動態視頻模式，用于葉綠素熒光參數測量；2）快照模式，用于GFP等熒光蛋白和熒光染料測量

?通訊模式：千兆以太網

?顯微鏡：Axio Imager M2，可選配Axio Scope A1簡潔版或Axio Imager Z2高級版

?物鏡轉盤：研究級7孔自動物鏡轉盤

?透射光快門

?聚光器 Achr Apl 0.9 H

?6位反光鏡轉盤

?雙目鏡筒(100:0/30:70/0:100)

?機械載物臺：75×50mm，硬膜陽極氧化表面

?樣品架：76×26mm

?物鏡：10倍、20倍、40倍、63倍和100倍專用生物熒光物鏡（可選）

?6位濾波輪：葉綠素熒光、GFP/SYTOX、DAPI/CTC等

?SM9000光譜儀

?入射狹縫：70µm×1400µm

?光柵：平場型校正

?光譜范圍：200-980nm

?波長精確度：<0.5nm

?再現性：<0.1nm

?溫度漂移：<0.01nm/K

?溫度調控模塊：溫度調節范圍 5℃-70℃，精確度0.1℃

?蠕動泵（選配）：流速10-5600µl/min，用于藻類連續培養測量

?FluorCam葉綠素熒光成像分析軟件功能：具Live（實況測試）、Protocols（實驗程序選擇定制）、Pre–processing（成像預處理）、Result（成像分析結果）等功能菜單

?客戶定制實驗程序協議（protocols）：可設定時間（如測量光持續時間、光化學光持續時間、測量時間等）、光強（如不同光質光化學光強度、飽和光閃強度、調制測量光等），具備專用實驗程序語言和腳本，用戶也可利用Protocol菜單中的向導程序模版自由創建新的實驗程序

?自動測量分析功能：可設置一個實驗程序（Protocol）自動無人值守循環成像測量，重復次數及間隔時間客戶自定義，成像測量數據自動按時間日期存入計算機（帶時間戳）

?快照（snapshot）模式：通過快照成像模式，可以自由調節光強、快門時間及靈敏度得到清晰突出的植物樣本穩態熒光和瞬時熒光圖片

?成像預處理：程序軟件可自動識別多個植物樣品或多個區域，也可手動選擇區域（Region of interest，ROI）。手動選區的形狀可以是方形、圓形、任意多邊形或扇形。軟件可自動測量分析每個樣品和選定區域的熒光動力學曲線及相應參數，樣品或區域數量不受限制（>1000）

?數據分析模式：具備“信號計算再平均"模式（算數平均值）和“信號平均再計算"模式，在高信噪比的情況下選用“信號計算再平均"模式，在低信噪比的情況下選擇“信號平均再計算"模式以過濾掉噪音帶來的誤差

?輸出結果：高時間解析度熒光動態圖、熒光動態變化視頻、熒光參數Excel文件、直方圖、不同參數成像圖、不同ROI的熒光參數列表等

葉綠素熒光與光譜分析結果

典型應用：

產地：捷克

參考文獻：

1.Küpper H, et al. 2019. Analysis of OJIP Chlorophyll Fluorescence Kinetics and QA Reoxidation Kinetics by Direct Fast Imaging. Plant Physiology 179: 369-381

2.Konert G, et al. 2019. Protein arrangement factor: a new photosynthetic parameter characterizing the organization of thylakoid membrane proteins. Physiologia Plantarum 166: 264-277.

3.Exposito-Rodriguez M, et al. 2017. Photosynthesis-dependent H2O2 transfer from chloroplasts to nuclei provides a high-light signalling mechanism. Nature Communications, 8: 49

4.Higo S, et al. 2017. Application of a pulse-amplitude-modulation (PAM) fluorometer reveals its usefulness and robustness in the prediction of Karenia mikimotoi blooms: A case study in Sasebo Bay, Nagasaki, Japan. Harmful Algae, 61:63-70

5.Jacobs M, et al. 2016. Photonic multilayer structure of Begonia chloroplasts enhances photosynthetic efficiency. Nature Plants, doi:10.1038/nplants.2016.162

6.Andresen E, et al. 2016. Cadmium toxicity investigated at the physiological and biophysical levels under environmentally relevant conditions using the aquatic model plant Ceratophyllum demersum. New Phytol., 210(4):1244-1258

7.Thomas G, et al. 2016. Deficiency and toxicity of nanomolar copper in low irradiance—A physiological and metalloproteomic study in the aquatic plant Ceratophyllum demersum. Aquatic Toxicology, 177:226-236

8.Fujise L, et al. 2014. Moderate Thermal Stress Causes Active and Immediate Expulsion of Photosynthetically Damaged Zooxanthellae (Symbiodinium) from Corals. PLOS ONE, DOI:10.1371/journal.pone.0114321

9.Gorecka M, et al. 2014. Abscisic acid signalling determines susceptibility of bundle sheath cells to photoinhibition in high light-exposed Arabidopsis leaves. Philosophical Transactions of the Royal Society B, 369(1640), DOI: 10.1098/rstb.2013.0234

10.Mishra S, et al. 2014. A different sequence of events than previously reported leads to arsenic-induced damage in Ceratophyllum demersum L. Metallomics, 6: 444-454

11.Ferimazova N, et al. 2013. Regulation of photosynthesis during heterocyst differentiation in Anabaena sp. strain PCC 7120 investigated in vivo at single-cell level by chlorophyll fluorescence kinetic microscopy. Photosynthesis Research, 116(1): 79-91

12.Andresen E, et al. 2013. Effects of Cd & Ni toxicity to Ceratophyllum demersum under environmentally relevant conditions in soft & hard water including a German lake. Aquatic Toxicology. 142–143, 15: 387–402